Plateau de Microscopies NSB3

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Service de préparation d’échantillons NSB3 pour la Microscopie Electronique

Notre service de microscopie NSB3 permet de préparer vos échantillons infectieux pour la microscopie électronique. L’imagerie est réalisé sur le plateau COMET de l’INM à Montpellier.

Prestations

Blocks de résine EPON pour sections semi-fines et préparation de grilles pour la microscopie électronique à transmission
Fixation chimique conventionnelle de tissus et mono-couches cellulaires
Immuno-marquage pour localiser les structures et objets d’intérêt.
Coloration négative pour l’imagerie de préparations de macromolecules, protéines, virus, organelles ou bacteries.

Combiné Bio-AFM / STED

Unique en Europe, notre combiné STED-AFM permet de réaliser en simultané une analyse corrélative par AFM (topographie et imagerie quantitative) et par fluorescence de super-résultion STED. Cet équipement est spécifiquement optimisé pour l’imagerie de pathogènes de classe 3 en conditions natives.

Echantillons :

Cellules fixées ou vivantes dans leur milieu de culture, bactéries, levures, macromolécules (acides nucléiques, protéines), polymères, fibres, composites, films lipidiques, vésicules lipidiques (GUV, LUV), vésicules extracellulaires (exosomes), structures biologiques purifiées (capsides virales par exemple), bactériophages, « virus-like particles » et virus de classe 2 et 3.

Taille des plus petits objets détectables en surface: quelques nanomètres X et Y
Hauteur des objets observables: de 0.5 nm à 12 µm
Dimension des images carrées: de 50 nm à 100 µm
Taille des échantillons observables: 30 mm x 50 mm en X et Y, 5 à 10 mm en Z
Possibilité de travailler en milieu liquide ou à l’air, dans une enceinte thermostatée

Equipement:

BioAFM Nanowizard 4xp (Bruker) spécifiquement modifié pour l’environnement NSB3 avec platine motorisée

Modes d’imagerie à l’air ou en liquide :

Imagerie Quantitative QI-mode et PeakForce QNM permettant d’acquérir simultanément des images topographiques et des mesures biophysiques : adhésion, élasticité, module de Young
Mode contact et Mode contact intermittent (AC mode)
Spectroscopie de force et cartographie quantitative
Fast scanning

XY scan: 100μm x 100μm, Z scan: 15μm

Porte échantillon chauffé de 18°C à 50 ° C, pour boîtes de Pétri de 35x10mm (plastique ou avec fond en verre) ou lamelles de verre de 25 mm.

Incubation C0₂ pour imagerie cellules vivantes + Injecteur double pompes dans la chambre d’incubation

Microscope Optique inversé NIKON Ti2-U avec contraste de phase et fluorescence

Objectifs :

Nikon CFI Lens Achromat LWD ADL-20x Ph1
Nikon CFI Achromat LWD ADL-40x Ph2
NIKON CFI planApo 100x oil (NA 1.45 lambda)

Source LED blanche et Epi-Fluorescence Intensilight 100w (Hg, manuel)

Cubes filtres :

GFP (Ex466 / 40, DM 495, stop filter BA 525/50)
mCHERRY, mRFP (Ex562 / 40, DM 593, BA 640/75 stop filter)
CY5, APC, DiD, Alexa Fluor 647, Alexa fluor 660 (Ex628 / 40, DM 660, BA 692/40 stop filter)

Caméra JENOPTIK Fluorescence ProgRes MFcool (2/3 “1.4 MegaPixel CCD, 1350×1024 pixel resolution, 14bit)

Module Confocal / STED – STEDYCON (Abberior)

Détection : 2 couleurs STED et 4 couleurs confocal

Excitation laser : 405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm

Bandes de détection : 420-480 nm, 505-550 nm, 575-625 nm, 650-700 nm

STED laser : 775 nm (pulsé)

Résolution STED (latéral) 30-40 nm

Champ : jusqu’à 90 µm x 80 µm

Autofocus hardware STEDYFOCUS

Microscopie TIRF et Super-Résolution PALM/STORM

Microscope Inversé pour l’imagerie de cellules vivantes en mode TIRF et super-résolution PALM-nSTORM

Notre microscope Nikon Ti-Eclipse est installé en espace confiné L3 pour l’imagerie de cellules vivantes infectées par microscopie de fluorescence à très haute résolution. Ce microscope est équipé d’un bras pour l’imagerie par réflexion totale interne (TIRF, total internal reflection fluorescence microscopy), ou onde évanescente, permettant d’étudier avec une très grande résolution la morphologie ou les évènements intervenant à la membrane plasmique de cellules vivantes.

Equipement :

Objectifs :

Nikon Plan Achromat 20x / N.A. 0.4
Nikon Plan Fluor 40x / N.A. 1.3 huile
Nikon SR APO TIRF 100x /N.A. 1.49 huile

- Lasers
  - 405 nm 100 mW
  - 488 nm 200 mW
  - 561 nm 500 mW
  - 642 nm 1W
- Cubes fluo
  - DAPI EX 377/50 DM 409 BA 447/60 (DAPI, HOECHST, AMCA, BFP, ALEXA FLUOR 350
  - FITC EX 482/35 DM 506 BA 536/40 (FITC, rsGFP, BODIPY, 5-FAM, FLUO-4, ALEXA FLUOR 488)
  - mCherry EX 562/40 DM 593 BA 640/75 (mCHERRY, mRFP)
  - Cube tétrabande pour SR C-NSTORM QUAD 405/488/561/647
- Camera EMCCD Andor IXON ULTRA (512×512, pixel 16µm, readout 17 MHz, 16-bit single, EM amplifier)
- Source LED blanche et épifluorescence Intensilight 100w (Hg, pilotée par NIS)
- Bras TIRF Nikon
- Platine motorisée XYZ avec système Perfect-Focus PFS et platine nanodrive Z MCL
- Chambre et porte-échantillon thermostatés
Pilotage avec le logiciel NIS Elements NIKON

Le microscope est installé dans une chambre d’incubation à 37°C pour maintenir la viabilité cellulaire.

Microscope passeur de plaques automatisé pour l’imagerie de cellules vivantes, Zebrafish et Organoïdes

Le Celldiscoverer 7 LSM900 Airyscan2 est un système d’imagerie de cellules vivantes automatisé entièrement intégré. Il est installé en espace confiné NSB3 pour l’imagerie de cellules vivantes infectées par microscopie de fluorescence en plein champ ou par imagerie confocale.

Spécificités :

• Automatisation des acquisitions et pilotage à distance

• Imagerie confocale haute sensibilité grâce aux détecteurs GaAsP et à l’ Airyscan 2

• Imagerie rapide grâce au mode multiplexe

• Résolution augmentée grâce à l’AiryScan 2

• Mode combiné des acquisitions plein-champs et confocales

Voir le site Zeiss France

Equipement :

Objectifs (optique adaptative) :

Zeiss Plan Apochromat 2,5x/0,12 5x/0,25 10x/0,35 (compatible plastiques et verre de 0.13 à 1.2 mm)
Zeiss Plan Apochromat 10x/0,35 20x/0,7 40x/0,7 (s’adapte aux plastiques et verres de 0.13 à 1.2 mm)
Zeiss Plan Apochromat immersion eau 25xx /1,.2 50x/1,2 100x/1,2 (s’adapte aux plastiques et verre de 0.13 à 0.21 mm)

Illumination BF : contraste brightfield, contraste oblique, contraste de phase adaptatif (PGC)

Fluorescence : unité d’illumination en fluorescence composée de 4 LEDs réparties en 2 unités Colibri

Imagerie Confocale LSM900 avec banc laser diode 405, 488, 561 et 640 nm

Les images confocales peuvent être combinées à une acquisition WF pour ne cibler que la couleur d’intérêt en mode confocal ou en mode SR.

Pilotage avec le logiciel ZEN Blue

Microscope inversé champ large avec illumination Spinning Disk pour l’imagerie de cellules vivantes

Microscope inversé ZEISS AXIO Observer pour l’acquisition en cellules vivantes
Module Spinning Disk CRESTOPTICS Crest XLight V2 (disque 50:250, 15K RPM)
Filtres DAPI / GFP / Cy3 / CY5/CFP/YFP/Cy7
Objectifs:
- Zeiss Plan-Apochromat 100x/1.4 huile
- Zeiss Plan Apochromat 63x/1.4 Oil DIC
- Zeiss LD LCI Plan-Apochromat 40x/1.2 DIC (water/glycerin)
- Zeiss Plan-Apochromat 20X / 0.8 Ph2
- Zeiss EC Plan-Neofluar 10X/0.3 Ph1
Source lasers: Celesta LUMENCOR 7 couleurs V (405 nm) B (446 nm) C (477 nm) T (520 nm), G (546 nm) R (636 nm) NIR (750 nm)
Camera qCMOS ORCA QUEST 2 ultra low noise mode, 120fps @4096×2034 full frame (4,6 µm x 4,6 µm pixel size),
Platine motorisée XYZ, multi-position
Contrôle de la température et chambre d’incubation CO₂
Software: ZEN Blue

Microscope à feuille de lumière structurée pour imagerie live 4D

L’InVi SPIM Lattice Pro (Bruker) est un microscope à feuille de lumière de dernière génération pour l’imagerie haute résolution d’échantillons vivants et fixés. Il utilise la technologie de modulateur spatial de lumière (SLM) pour générer une grande variété de motifs de faisceaux d’illumination, permettant une illumination optimale pour chaque échantillon et chaque application. Une configuration inversée avec deux objectifs à haute ouverture numérique (un pour l’illumination et un pour la détection), ainsi qu’une chambre d’imagerie entièrement contrôlée sur le plan environnemental, permet des acquisitions à long terme en utilisant une variété de schémas d’illumination.
Lasers : Jusqu’à 5 lignes laser (405, 488, 561, 642 et 685 nm) correction chromatique, jusqu’à 20 filtres d’émission et acquisition bicolore, garantissant un large spectre d’applications.
Objectif de détection : Nikon CFI Apo 25× W à 1,1 NA, immersion eau, avec bague de correction.
Objectif d’illumination : Objectif à immersion eau Special Optics 28,6×, 0,7 NA.
Changeur de grossissement : Grossissements finaux de 31,3× et 62,5× optimisant le champ de vision (FOV) et la taille des pixels.
Détection bi-canal : Deux caméras sCMOS Hamamatsu ORCA Flash, chacune équipée de jusqu’à 10 filtres, séparées par deux miroirs dichroïques sélectionnables
Module de Photomanipulation 488 nm
Contrôle de la température et chambre d’incubation CO₂

Installés dans l’espace confiné L3, les microscopes du CEMIPAI permettent d’accéder à l’imagerie haute résolution de cellules vivantes infectées ou d’agents pathogènes en milieu natif. Ce plateau d’imagerie L3 est unique en France.

Pour une résolution encore plus poussée, le CEMIPAI propose en parallèle un service de préparation d’échantillons L3 pour la microscopie électronique. Les échantillons sont ensuite observés et analysés en MET sur le plateau d’imagerie COMET à Montpellier.

Sébastien Lyonnais

Responsable de Service

Ingénieur de Recherche CNRS, PhD

Amandine Blanco

Ingénieure d’études CNRS, PhD

Aymeric Neyret

Ingénieur d’études HC Univ. Montpellier

Selected Publications

Partiot, E., Hirschler, A., Colomb, S. et al. Brain exposure to SARS-CoV-2 virions perturbs synaptic homeostasis. Nat Microbiol 9, 1189–1206 (2024). https://doi.org/10.1038/s41564-024-01657-2
Arone C, Martial S, Burlaud-Gaillard J, Thoulouze M, et al. HTLV-1 biofilm polarization maintained by tetraspanin CD82 is required for efficient viral transmission. mBio 14:e01326-23 (2024). https://doi.org/10.1128/mbio.01326-23
Gourdelier, M., Swain, J., Arone, C. et al. Optimized production and fluorescent labeling of SARS-CoV-2 virus-like particles. Sci Rep 12, 14651 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18681-z
Lyonnais, S., Hénaut, M., Neyret, A. et al. Atomic force microscopy analysis of native infectious and inactivated SARS-CoV-2 virions. Sci Rep 11, 11885 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-91371-4
Fernandez, J., Machado, A.K., Lyonnais, S. et al. Transportin-1 binds to the HIV-1 capsid via a nuclear localization signal and triggers uncoating. Nat Microbiol 4, 1840–1850 (2019). https://doi.org/10.1038/s41564-019-0575-6

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